Kit de mini-préparation de plasmide sans endo

Le kit utilise une solution tampon spécialement formulée, combinée à la technologie d'adsorption réversible de l'acide nucléique par membrane de gel de silice, peut éliminer presque complètement les endotoxines, les protéines et autres impuretés de 1 à 5 ml de culture d'Escherichia coli, et le rendement en ADN plasmidique est de 5 ~20 ug. Le plasmide extrait peut être utilisé dans des expériences biologiques telles que la digestion par des enzymes de restriction, la réaction de ligature, l'amplification PCR, le séquençage, la transformation, la transfection, etc.

La RNase A est expédiée avec de la glace humide et stockée à -20 degrés. D'autres réactifs sont expédiés et stockés à température ambiante ; valable 12 mois.

1. De l'éthanol anhydre et un tube à centrifuger de 1,5 ml sans nucléase sont nécessaires mais ne sont pas fournis dans ce kit.

2. Préparez un bain-marie ou un module chauffant à 42 degrés.

3. Ajoutez toute la RNase A fournie dans le kit au tampon P1 avant utilisation, et elle peut être conservée à 4 degrés pendant 6 mois.

4. Veuillez ajouter 60 ml d'éthanol anhydre au tampon PW avant utilisation.

5. Si le tampon P2 précipite, veuillez le chauffer dans un bain-marie à 37 degrés pendant quelques minutes pour restaurer la clarification. Après avoir utilisé le Buffer P2, le couvercle doit être fermé immédiatement pour éviter tout contact à long terme avec l'air.

6. Veuillez pré-refroidir le tampon P3 à 4 degrés avant utilisation.

1. Balance de la colonne : ajoutez 500 μL de tampon BL à la mini-colonne HiBind DNA (la mini-colonne HiBind DNA est placée à l'avance dans le tube de prélèvement), centrifugez à 12,000 tr/min pendant 1 min à température ambiante, jetez le filtrat. , et remettez la colonne d'ADN HiBind dans le tube de prélèvement (il est préférable d'utiliser la colonne traitée immédiatement).

2. Récoltez la culture bactérienne à partir de 1 à 5 ml de liquide bactérien frais par centrifugation à 12,000 tr/min pendant 1 min à température ambiante (retirez le surnageant autant que possible).

3. Ajoutez 250 μL de tampon P1 (veuillez vérifier si vous devez d'abord ajouter ou non la RNase A), utilisez une pipette ou un oscillateur vortex pour bien suspendre les bactéries (assurez-vous de bien disperser les bactéries, sinon cela affectera la lyse, ce qui entraînera faible qualité et pureté du plasmide extrait).

4. Ajoutez 250 μL de tampon P2, retournez-le immédiatement et doucement 8 à 10 fois pour que les bactéries soient complètement lysées (cette étape ne doit pas être violemment secouée et doit être effectuée dans les 5 minutes). À ce stade, la solution doit devenir claire et collante. Si elle ne devient pas claire, il se peut qu'il y ait trop de bactéries et que la lyse ne soit pas complète, et il convient d'envisager de réduire la quantité de bactéries.

5. Ajouter 250 μL de tampon P3 (pré-refroidir à l'avance), immédiatement et doucement à l'envers 10 à 12 fois, la solution apparaît en agglomérat compact, centrifuger à 12,000 tr/min pendant 10 min à température ambiante, transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 ml.

6. Ajoutez 75 µL de Buffer ER, placez 10 min sur la glace après avoir mélangé à l'envers (mélangez à l'envers 3 à 5 fois pendant la période), la solution est bleue transparente.

7. Incuber à 42 degrés pendant 5 min, la solution retrouve sa turbidité. Centrifuger à 12,000 tr/min pendant 10 min à température ambiante, la solution est divisée en couches supérieure et inférieure, la couche supérieure est en phase aqueuse claire et la couche inférieure est bleue. Recueillez soigneusement la phase aqueuse supérieure dans le nouveau tube à centrifuger Nuclease-Free de 1,5 mL.

8. Ajoutez de l'éthanol anhydre 0,5 fois le volume de la solution ci-dessus, mélangez à l'envers et transférez dans la mini-colonne HiBind DNA (pas plus de 700 μL à chaque fois). Centrifuger à 12,000 tr/min pendant 1 min à température ambiante, jeter le filtrat dans le tube de collecte. Remettez la mini-colonne HiBind DNA dans le tube de prélèvement (la solution peut traverser la colonne plusieurs fois).

9. Ajoutez 600 μL de tampon ED à la mini-colonne HiBind DNA, centrifugez à 12,000 tr/min pendant 1 min à température ambiante, jetez le filtrat dans le tube de prélèvement. Remettez la mini-colonne HiBind DNA dans le tube de prélèvement.

10. Ajoutez 600 μL de tampon PW à la mini colonne HiBind DNA, centrifugez à 12 000 tr/min pendant 1 min à température ambiante, jetez le filtrat dans le tube de prélèvement. Remettez la colonne d’ADN HiBind Mini dans le tube de prélèvement.

11. Répétez l'étape 10.

12. Centrifugez à 12,000 tr/min pendant 2 min à température ambiante, placez la mini-colonne HiBind DNA dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 ml sans nucléase. Ouvrir le couvercle et placer 5 min à température ambiante pour volatiliser complètement l'éthanol.

13. Ajoutez 50 μL de tampon TE ou d’eau sans Endo au centre de la membrane de la mini colonne HiBind DNA et placez-la à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 12,000 tr/min pendant 2 min. Si vous avez besoin d'augmenter l'efficacité de la récupération du plasmide, la solution obtenue peut être réajoutée à la mini colonne HiBind DNA, placée à température ambiante pendant 2 min et centrifugeuse à 12 000 tr/min pendant 2 min.

14. L'ADN plasmidique obtenu peut être conservé pendant une longue période à -20 degré.

1. Veuillez lire attentivement le manuel du produit avant utilisation.

2. Lorsque le nombre de copies du plasmide extrait est faible ou que le fragment plasmidique est supérieur à 10 Ko, la quantité de bactéries collectées doit être augmentée et la dose de tampon P1, de tampon P2 et de tampon P3 doit être augmentée dans des proportions égales.

3. L'éthanol doit être complètement volatilisé avant d'éluer le plasmide pour éviter l'influence de l'éthanol résiduel sur les expériences en aval.

4. Le tampon TE peut être préchauffé à 60 ~ 65 degrés et le temps d'incubation de l'élution peut être prolongé pour améliorer l'efficacité de l'élution.

5. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables.

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